本发明公开了一种检测动物源性食品中头孢类抗生素的间接竞争ELISA试剂盒及其应用，包括包被有包被原的酶标板、头孢类抗生素标准品、头孢类抗生素通用抗体、酶标记二抗、稀释缓冲液、洗涤缓冲液、底物显色液和反应终止液；头孢类抗生素通用抗体能特异性识别头孢氨苄、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢哌酮、头孢唑啉或头孢噻肟，不能识别青霉素钠。本发明制备出一种头孢类抗生素通用抗体，该通用抗体和大部分头孢类抗生素均有较高的交叉反应率，而对于同含有β‑内酰胺环的结构类似物青霉素钠却几乎没有交叉反应，表明该通用抗体具有较高的特异性。采用该通用抗体制备的试剂盒具有敏感度高、检测药物种类多、成本低、操作简单、检测时间短的优点。