本发明公开了提高单链抗体酵母展示文库质量的起始载体，在含有Aga2p基因的酵母表面展示载体的Aga2p的C末端插入5’到3’方向依次排列的核糖体跳跃肽基因片段和筛选标记基因片段获得。并且公开了该起始载体的构建方法及应用。通过本发明起始载体可以在文库筛选前剔除含有内部终止密码子片段的载体，进而使完整的单链抗体更好地展示在细胞表面，减少不完整单链抗体对抗原抗体特异性结合的影响，提高筛选效率，有利于得到高特异性单链抗体。