本发明提供了一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法及应用，所述制备方法包括以下步骤：步骤1、预处理肝肿瘤组织；步骤2、分步酶解；利用酶溶液分步酶解步骤1中的预处理后的肝肿瘤组织，并过滤后收集每一步的酶解液，得到细胞悬液；步骤3、梯度离心；利用细胞分离液对细胞悬液进行梯度离心，分离免疫细胞和肝实质细胞；步骤4、红细胞裂解；用红细胞裂解液对步骤3获得的免疫细胞进行红细胞裂解，并离心清洗，获得免疫细胞沉淀；步骤5、收集步骤3中的肝实质细胞和步骤4中的免疫细胞沉淀，用细胞清洗液清洗后离心获得细胞沉淀，用细胞重悬液重悬细胞沉淀并过滤，得到所述肝肿瘤组织单细胞悬液。