本发明涉及一种基于突变蛋白构建的多层次虚拟筛选，以及筛选抑制剂在预防和/或治疗β‑catenin蛋白介导的恶性肿瘤疾病中的应用。在构建三种突变蛋白的三维结构的基础上，通过分别分析第一次虚拟筛选得到的结合能排名前1％小分子化合物种类，选取黄酮类化合物作为第二次筛选库再次进行虚拟筛选，获得三种突变β‑catenin与黄酮类化合物的对接得分结果，得到排名前1％化合物，进行分子对接与活性研究以验证其抑制效果。本发明通过构建突变蛋白的三维pdb文件获得筛选的受体蛋白，经过多层次的虚拟筛选，自建二次虚拟筛选配体文库，丰富了该种类配体品种，在降低实验筛选化合物数量的同时，有效提升虚拟筛选精确率，缩短研发周期和节约成本，具有治疗和/或预防突变β‑catenin蛋白介导的恶性肿瘤疾病上的应用前景。