本发明公开了一种通用型制备高活性的小鼠胰腺离体组织单细胞悬液的方法及多种应用。涉及生物检测技术领域，特别是一种用于制备胰腺导管腺癌小鼠胰腺组织单细胞悬液的方法。由于胰腺导管腺癌的组织结构复杂、细胞紧密相连，传统的细胞分离方法存在困难，影响了单细胞测序技术的准确性和可靠性。为解决这一问题，本发明提供了一种混合酶液，包括IV型胶原酶、Dispase II、胰蛋白酶抑制剂、胎牛血清、DNAse I和细胞培养基，用于制备小鼠胰腺组织单细胞悬液。该方法简单、方便，能够获得高活性、高分散的单细胞悬液，有助于深入研究胰腺导管腺癌的微环境。