本发明公开一种粒径可控的荧光聚多巴胺纳米粒子的制备及其用于胰蛋白酶检测。其特征是通过将多巴胺在碱性条件下搅拌自聚合成聚多巴胺纳米颗粒，再加入H2O2，控制时间和温度可将聚多巴胺纳米颗粒分解成粒径小于5 nm的荧光聚多巴胺纳米粒子。本发明的制备方法步骤简单，使用绿色环保的源材料，产物粒径可控。本发明的荧光聚多巴胺纳米粒子，其表面富含负电荷，具有良好的荧光性能，与阳离子鱼精蛋白通过静电吸附和氢键作用聚集而猝灭荧光，因胰蛋白酶特异性水解鱼精蛋白，仅通过简单的混合操作，根据聚多巴胺纳米粒子荧光的恢复，实现胰蛋白酶的检测，并且胰蛋白酶的最低检出限可达到6.4 ng/mL。