本发明公开了一种环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法，先提取环境样品中的DNA，获取DNA样品，通过实时荧光定量PCR方法测定DNA样品中的分类基因总浓度，再通过第二代高通量测序方法获得环境样品中微生物不同界、门、纲、目、科、属、种的分类基因相对丰度，最后将DNA样品的分类基因总浓度与微生物不同界门纲目科属种的分类基因的相对丰度相乘，计算得到微生物不同界门纲目科属种的分类基因的绝对丰度，实现了微生物群落结构绝对丰度的高通量快速测定，使得跨样本比较更为可靠，实质反映物种的增长与减少，为进一步探究微生物群落结构提供技术支撑。