本发明公开了一种水凝胶固定化的微生物保藏方法，涉及固定化生物技术领域，包括：将微生物通过包埋的方法固定在水凝胶固定化载体中，常温下贮藏保存。其中，载体为复合凝胶球，包括：包埋填料，包括N‑(1,8‑二甲基咪唑并[1,2‑a]喹喔啉‑4‑基)‑1,2‑乙二胺改性的壳聚糖微球；骨架材料，包括海藻酸钠，与包埋填料形成具有互穿或半互穿的网络结构。本发明提供的微生物保藏方法以水凝胶为载体，通过固定化技术包埋在载体中，可实现常温长时间贮藏保存及运输；且制得的复合凝胶球载体具有良好的抗压强度，孔隙率高，稳定性好，更有利于微生物附着。