本发明提供了一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的构建方法及应用，属于病毒技术领域。本发明通过分段扩增的方法将新型鹅细小病毒SD株的完整基因组克隆至质粒pBluescript II SK，获得重组质粒；同时利用重叠PCR技术将基因组中NcoⅠ位点突变，作为鉴定野毒与拯救病毒的遗传标记；然后将重组质粒与转染试剂混合，通过卵黄囊与尿囊腔途径接种SPF鸭胚，获得拯救病毒。本发明建立的新型鹅细小病毒反向遗传操作系统，可用于新型鹅细小病毒毒力分析、跨种传播机制等方向的研究，同时也为研究鸭短喙与侏儒综合征的新型疫苗奠定了基础。