本发明涉及荧光免疫检测技术领域，具体公开一种诺氟沙星的检测方法。包括以下步骤：将诺氟沙星单克隆抗体与生物素偶联，得免疫配基；将所述免疫配基与羧基化纳米Fe3O4微球偶联，得免疫磁珠；将链霉亲和素与羧基化水溶性发绿光上转化纳米粒子偶联，得荧光信号探针；将所述免疫磁珠加入待测样品中，加入磁场分离富集样品，再加入荧光信号探针，充分反应后磁分离富集样品，得样品溶液；将所述样品溶液滴加至含有诺氟沙星人工抗原的免疫层析试纸条上，观察结果。本发明提供的方法实现了快速分离目标物、双重信号放大提高检测灵敏度和增加检测系统稳定性的目的，能够实现对大量未知样品的简单快速筛选，检测成本低，有利于在实践中推广应用。