本发明公开了一种同时测血清中尼古丁、3-(吡咯烷-2-基)吡啶、吡啶吡咯酮以及睾酮含量的方法。该方法简单快速、检测灵敏度高、针对性强、适用范围广，经验证该方法对四种目标物的测定均具有较高的回收、良好的线性关系、较低的定量限，可一次同时检测多种目标物，快捷高效。该发明的前处理方法、液相方法以及部分液质方法同样适用于血清中与上述四种成分性质相近的其他目标物分析，适用性较强。