本发明公开了一种测定生物膜内溶氧扩散系数的装置及方法，本发明的装置包括气体输送装置、进气加湿瓶、生物膜测试室和溶氧微电极系统。利用该装置进行溶氧扩散系数测定的方法是：将待测生物膜样品放入生物膜测试室中，通入氮气，将体系中的氧气浓度降至最低。随后将进气改为氧气，同时用溶氧微电极记录生物膜内溶氧随时间变化的曲线。在生物膜不同位置不同深度重复这一实验，获得多个样本数据。通过数学模型模拟这一过程并拟合模型数据及实验测得数据，计算溶氧扩散系数。本发明耗时短，且不需要精密的化学分析，因此测定结果准确，重复性好，系统误差非常小。