本发明提供了一种单柱两相液相色谱整体柱及其制备方法和应用，整体柱的制备方法包括以下步骤：制备亲水模式预聚溶液和疏水模式预聚溶液；向亲水模式预聚溶液和疏水模式预聚溶液内加入N,N‑二甲基苯胺后，将二者加入同一柱管内，得到混合模式整体柱。采用本发明中的方法制备得到的混合模式整体柱，具有较好的机械强度和渗透性，通过调节流动相中有机相的比例，实现疏水和亲水双模式的转化，利用此两相聚合物整体柱可以对羽扇豆醇进行有效的在线富集，同时对实际样品中的羽扇豆醇具有一定的纯化能力。本发明方法具有制备方法简单，经济实用等技术特点。