本发明涉及一种新型转座子突变株文库的构建系统，构建步骤如下：⑴构建一个在ITRs区域中额外添加了转座酶基因tnpA的新型转座子质粒载体；⑵在ITRs区域中额外添加的转座酶基因tnpA能够受到阿拉伯糖启动子基因araBAD和阿拉伯糖抑制蛋白基因araC调控；⑶获得一个含有转座子的不同物种的转座子突变株；⑷该转座子突变株在基因组的任一位置上具有一个转座子插入序列；⑸随机获得全基因组范围内多种插入基因形式的转座子突变株文库。本发明构建系统可以系统高效地得到覆盖全基因组的革兰氏阴性菌转座子突变株文库，有助于研究基因组注释和功能分析。