本发明关于中药成分分析技术领域，尤其涉及一种黄芪中化学成分的分离方法及其应用。本发明所提供的分离方法基于离线三维液相色谱高分辨质谱联用技术，通过使用分离机制不同的色谱柱以及特定的流动相、流速和洗脱梯度，提高了色谱的峰容量，并获得了良好的分离度，可对黄芪进行低含量成分的分离与鉴定，从而能够用于黄芪系统物质基础研究，实现黄芪中化学成分的深度表征。