本发明涉及一种层层自组装的靶向纳米粒子的制备方法，所述方法在透明质酸上通过化学键连接难溶性疏水药物，通过自组装再包载相同的或不同的疏水性药物，得自组装纳米粒子；将聚赖氨酸和靶向配体分子通过化学键连接；通过层层自组装在纳米粒子的最外层根据需要分别覆盖透明质酸、聚赖氨酸或聚赖氨酸-靶向配体，即得靶向纳米粒子。本方法制得的靶向纳米粒子载药量高，且可以通过EPR效应和靶向配体实现被动和主动靶向肿瘤，所选择的载体材料本身也具有功能性，而透明质酸通过结合肿瘤部位高表达的CD44受体也具有肿瘤靶向作用；本方法制得的靶向纳米粒子可以同时包载具有协同作用的两种药物，提高药物稳定性、靶向性，较少用药量和毒性。