本发明公开了一种小鼠单倍体干细胞的获得方法，包括如下步骤：步骤一、将p53敲除的小鼠单倍体胚胎干细胞通过显微注射的方法，注射到野生型小鼠囊胚中得到重构胚胎；步骤二、将重构胚胎移植回0.5天的假孕母鼠的输卵管或2.5天假孕母鼠的子宫中，在胚胎发育到E6.5天时进行解剖，分离上胚层区域；步骤三、将上胚层区域种在培养基中培养，最终形成小鼠单倍体上胚层干细胞。本发明通过p53-KO的方法，有效抑制了单倍体干细胞在体内分化过程中的自发二倍化，并借助嵌合体技术在体外成功建立了来源于着床后上胚层组织的小鼠单倍体上胚层干细胞系。