本发明涉及一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法，包括步骤有：包含牛miR-133b基因序列的目的序列的获取：表达载体pEGFP-C1-miR133b的构建：pEGFP-C1-miR133b转染牛骨骼肌卫星细胞：一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法的应用，通过牛骨骼肌卫星细胞过表达微小RNA miR-133b的获取，利用miR-133b的作用，提高牛骨骼肌卫星细胞的体外增殖能力，并有效抑制其分化。本发明利用pEGFP-C1构建miR-133b的过表达载体，利用微小RNA对牛肌卫星细胞的增殖和分化进行调控，得到高纯度的牛肌卫星细胞，为研究各调控因子在肌卫星细胞增殖与分化过程中的功能和影响提供良好的细胞模型。