本发明涉及一种天然生物交联的纳米复合三维凝胶支架及制备方法。所述水凝胶含有丙烯酰胺类单体M1、无机纳米粘土M2、生物高分子M3和生物交联剂京尼平M4，四者用量的质量百分比为：55-90∶7-25∶3-20∶0-5。本发明制备方法是在水溶液中以M2作为M1的交联剂，M4作为M3的交联剂，采用原位自由基聚合和相分离冷冻干燥法制备生物相容性和力学性能优异的纳米复合三维凝胶支架。该方法操作简便可控，无需大型设备，水相反应无毒无害，不污染环境。生物交联剂的引入提高了支架的机械强度，细胞可在支架内外部分生长和增殖，为组织再生提供良好的微环境。本发明纳米复合三维凝胶支架可用于医用移植、药物释放和细胞培养。