本发明属于分离纯化技术领域，提供了一种高纯千金藤素的分离方法，包括以下步骤：A、将山乌龟片、地不容或含有千金藤素的防己科中药材为原料用研钵捣碎至粉末，加入提取剂超声提取20min后减压旋蒸浓缩除去提取剂；B、将步骤A中得到的提取液过硅胶柱进行层析，经洗脱后得到千金藤素粗品；C、将千金藤素粗品，通过0.45μm的膜后，经制备液相色谱进行纯化；D、将步骤C中得到的馏分经35℃下减压旋蒸除去甲醇，冷冻干燥，得白色固体，即纯化千金藤素。本发明的方法千金藤素纯度高，分离工艺简单可控，非常易于工业化生产的自动化。