本发明提供了一种流式细胞仪光谱重叠信号数字处理方法，所述方法包括以下步骤：1)利用互相关算法对荧光信号相对于散射光信号的时延进行估计，并对电路系统引入的时延进行校正，得到荧光信号相应的荧光寿命，2)利用得到的荧光寿命τ1，τ2对检测到的类高斯脉冲信号进行人为调制，利用相移特征对时延量进行表征，3)引入具有特定相移特性的参考信号，实现原始脉冲信号的频谱迁移，并经过低通滤波实现光谱重叠影响的消除。