本发明提出了一种基于高级次轴对称偏振光束的表面等离子体增强全内反射荧光显微成像方法，包括步骤：激光器发出的激光束经过针孔滤波器进行空间滤波，被准直透镜准直为平行光束；该平行光束入射到偏振转换系统中进行偏振态转换；获得的高级次轴对称偏振光束进一步通过光瞳滤波器和环形光阑进行振幅及相位调制；调制后的高级次轴对称偏振光束经过二向色分束镜反射到高数值孔径的聚焦物镜中进行聚焦，并射入“玻璃基底-金属薄膜-样品”的三层结构上；激发的荧光信号通过该三层结构反射回聚焦物镜中，并被其扩束，通过二向色分束镜透射，经过滤波片滤波后，最终被一聚光镜聚焦到针孔阵列板上，通过探测器将光信号转换为电信号，并进一步处理。