本发明公开了一种用于构建hpRNA的载体、构建方法及其应用。本发明提供的DNA片段，自上游至下游依次包括启动子、DNA片段A、loop核苷酸序列、DNA片段B、DNA片段C和终止子；DNA片段A依次由LIC处理单核苷酸终止位点，LIC1片段、限制性内切酶A识别位点、与LIC3片段反向互补的脱氧核糖核苷酸组成的片段和LIC处理单核苷酸终止位点互补位点组成；DNA片段B依次由LIC处理单核苷酸终止位点、LIC2片段和限制性内切酶B识别位点组成；DNA片段C依次由限制性内切酶C识别位点、与LIC4片段反向互补的脱氧核糖核苷酸组成的片段和LIC处理单核苷酸终止位点互补位点组成。应用本发明的DNA片段构建hpRNA载体，只需进行一步克隆，大大提升了构建的效率，节约了成本，几乎100％阳性，表现出良好的性能及稳定性，可以在顺式表达水平以及转基因水平中获得有效转录后基因沉默。